Ricerche

Ricercatori dell'Università dell'Illinois di Urbana-Champaign riferiscono di aver applicato un nuovo strumento di editing [=modifica] genetico per aiutare i macchinari cellulari a saltare parti dei geni responsabili delle malattie, per ridurre la formazione di precursori della placca di amiloide-beta (Aβ) in topi modello del morbo di Alzheimer (MA).

L'applicazione nei topi vivi mostra una migliore efficienza dello strumento, chiamato SPLICER, rispetto allo standard attuale nella tecnologia di editing genico, nonché il suo potenziale in altre malattie, hanno affermato i ricercatori che, guidati da Pablo Perez-Pinera, professore di bioingegneria dell'U.of I., hanno pubblicato i risultati su Nature Communications.

Lo SPLICER usa un approccio di editing genico chiamato 'salto di esone' (exon skipping), che è di particolare interesse per le condizioni di salute causate da mutazioni che producono proteine ​​mal ripiegate o tossiche, come la distrofia muscolare di Duchenne o l'Huntington. Perez-Pinera ha detto:

“Il DNA contiene le istruzioni per costruire tutto ciò che è responsabile di come funzionano le cellule. Quindi è come un libro di ricette che contiene istruzioni di cucina molto dettagliate. Ma ci sono grandi regioni di DNA che non codificano nulla. È come se tu iniziassi la ricetta per cucinare un tacchino, e poi trovi una nota che dice 'Continua a pagina 10'. Dopo pagina 10, c'è 'Continua a pagina 25'. Le pagine nel mezzo hanno solo parole senza senso.

“Ma ipotizziamo che una delle pagine delle ricette - in genetica, un esone - abbia un errore di battitura che rende il tacchino non commestibile o addirittura velenoso. Se non riusciamo a correggere direttamente l'errore, potremmo modificare la nota prima di passare alla pagina successiva, saltando la pagina con l'errore, in modo che alla fine tu possa fare un tacchino mangiabile. Anche se potresti perdere il sugo che era sulla pagina saltata, avresti comunque cenato. Allo stesso modo, se potessimo saltare il pezzo del gene con la mutazione tossica, la proteina risultante potrebbe essere ancora abbastanza funzionale per svolgere i suoi ruoli cruciali".

Lo SPLICER si basa sulla popolare piattaforma di editing genico CRISPR-Cas9, con cambiamenti chiave. I sistemi CRISPR-Cas9 richiedono una sequenza di DNA specifica su cui aggrapparsi, limitando i geni che possono essere modificati. Lo SPLICER usa nuovi enzimi Cas9 che non hanno bisogno di quella sequenza, aprendo la porta a nuovi obiettivi come il gene correlato al MA su cui si è concentrato il gruppo della Illinois.

"Un altro problema che affrontiamo nel nostro lavoro è la precisione in ciò che viene saltato", ha detto il dottorando Angelo Miskalis, un primo coautore dello studio. "Con le attuali tecniche di 'salto di esone', a volte non tutto l'esone viene saltato, quindi c'è ancora parte della sequenza che non vogliamo sia espressa. Nell'analogia del libro di cucina, è come provare a saltare una pagina, ma la nuova pagina inizia nel mezzo di una frase, e ora la ricetta non ha senso. Volevamo evitarlo".

Esistono due aree di sequenza chiave che circondano un esone, che indicano ai macchinari cellulari quali parti di un gene da usare per creare proteine: una all'inizio e una alla fine. Mentre la maggior parte degli strumenti 'salta esone' punta a una sola sequenza, lo SPLICER modifica le sequenze sia iniziali che finali. Di conseguenza, gli esoni mirati vengono saltati in modo più efficiente, ha detto Miskalis.

Il gruppo della Illinois ha scelto di puntare il gene di MA per la prima dimostrazione delle capacità terapeutiche di SPLICER perché, anche se il gene obiettivo è stato ben studiato, un 'salto di esone' efficiente è rimasto sfuggente negli organismi viventi. I ricercatori hanno puntato una codifica specifica dell'esone per una sequenza di aminoacidi all'interno di una proteina che viene scissa per formare l'Aβ, che si accumula per formare placche sui neuroni nel cervello man mano che la malattia avanza.

Nei neuroni in coltura, lo SPLICER ha ridotto la formazione di Aβ in modo efficiente. Quando hanno analizzato la produzione di DNA e RNA del cervello dei topi, i ricercatori hanno scoperto che l'esone mirato era diminuito del 25% nei topi trattati con SPLICER, senza prove di effetti fuori bersaglio (=non desiderati).

"Quando inizialmente abbiamo cercato di puntare questo esone con tecniche più vecchie, non ha funzionato", ha dichiarato Shraddha Shirguppe, prima coautrice dello studio. “Combinare i nuovi editori di base con l'editing a doppia giunzione ha saltato l'esone a un ritmo molto migliore di quanto potevamo fare prima con uno qualsiasi dei metodi disponibili. Abbiamo dimostrato che non solo potrebbe saltare meglio l'intero esone, ma ha ridotto la proteina che produce la placca in queste cellule".

"L'exon skipping funziona solo se la proteina risultante è ancora funzionale, quindi non può trattare ogni malattia con una base genetica. Questa è la limitazione complessiva dell'approccio", ha detto Perez-Pinera. "Ma per malattie come il MA, la distrofia muscolare di Duchenne, il Parkinson o l'Huntington, questo approccio ha un grande potenziale. Il prossimo passo immediato è esaminare la sicurezza di rimuovere gli esoni puntati in queste malattie e assicurarsi che non stiamo creando una nuova proteina tossica o perdere una funzione chiave. Dovremmo anche fare studi sugli animali più a lungo termine e vedere se la malattia progredisce nel tempo".